上海金畔生物科技有限公司代理AAT Bioquest荧光染料全线产品，欢迎访问AAT Bioquest荧光染料官网了解更多信息。
Amplite NAD/NADH比率检测试剂盒(比色法)
 |
货号 | 15273 | 存储条件 | 在零下15度以下保存, 避免光照 |
| 规格 | 250 Tests | 价格 | 4584 | |
| Ex (nm) | 460 | Em (nm) | ||
| 分子量 | 溶剂 | |||
| 产品详细介绍 | ||||
简要概述
Amplite NAD/NADH比率检测试剂盒（比色法）是美国AAT Bioquest研发的检测NAD/NADH的试剂盒，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）是细胞中发现的两种重要的辅酶。 NAD形成NADP，通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2’位置。 NADH（NADPH）是NAD（NADP）的还原形式，NAD（NADP）是NADH（NADPH）的氧化形式。 NAD或NADP在氧化还原反应中起辅助因子的作用，在细胞反应中转移电子。 氧化形式和还原形式之间的平衡是NAD / NADH（NADP / NADPH）比率。 该比率是指示细胞氧化还原状态的重要组分，并且它是反映代谢活性和细胞健康的测量。 在健康的哺乳动物组织中，游离NAD +和NADH之间的比率的估计可以高达700.相反，NADP / NADPH比率通常为约0.005，因此NADPH是该辅酶的主要形式。
该Amplite 比色NAD / NADH比率分析试剂盒提供了一种比色法，用于测量培养细胞中细胞内总NAD / NADH量和NAD / NADH比率。 在该测定中，裂解物中的NAD可以用NAD提取溶液提取并通过酶反应转化为NADH，然后通过NADH探针识别，在反应后得到黄色染料，其在460nm处具有吸光度。 产生的染料量与细胞裂解物中NAD或NADH的浓度成正比，可用作细胞NAD / NADH浓度的指示剂。金畔生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供最优质的NAD/NADH检测试剂盒。
适用仪器
| 光吸收酶标仪 | |
| 吸收： | 460nm |
| 推荐孔板： | 透明底板 |
产品说明书
96孔板检测示例
概述
准备25μLNADH标准品和/或测试样品在室温下
加入25μLNAD提取液孵育15分钟
加入25μL中和溶液加入75μLNAD/ NADH反应混合物在
室温下孵育15分钟至2小时
监测 在460nm处的吸光度
注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。
操作步骤
1.准备NADH储备溶液：
将200μLPBS缓冲液加入到NADH标准品（组分C）的小瓶中，得到1mM（1nmol / L）NADH储备溶液。
注意：未使用的NADH储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。
2.准备NAD / NADH反应混合物：
2.1将8 mL NADH探针缓冲液（组分B-II）加入到NAD / NADH回收酶混合物（组分A）的瓶中，并充分混合。
2.2将2 mL NADH探针（组分B-I）加入上述瓶中（来自步骤2.1）并充分混合。
注意：这种NAD / NADH反应混合物足以进行125~200次分析。 未使用的NAD / NADH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。
3.准备连续稀释的NADH标准品（0至10μM）：
3.1将10μL1mMNADH储备溶液（来自步骤1）加入990L PBS缓冲液（pH7.4）中，得到10μM（10pmol / L）NADH标准溶液。
注意：稀释的NADH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。
3.2取200μL10M NADH标准溶液（来自步骤3.1）进行1：2连续稀释，得到5,2.5,1.25,0.625,0.313,0.156,0.078和0 M系列稀释的NADH标准品。
4.运行总NAD / NADH分析（总共400个分析/试剂盒）：
4.1如表1和2中所述，将含有NADH标准品和含NAD / NADH的测试样品的系列稀释液加入白色/透明底96孔微孔板中。
注意：根据需要准备细胞或组织样本NAD / NADH裂解缓冲液（组分G）可用于裂解细胞（详见附录）。
表1.白色/透明底96孔微孔板中NADH标准品和测试样品的布局
|
BL |
BL |
TS |
TS |
|
NS1 |
NS1 |
…. |
…. |
|
NS2 |
NS2 |
|
|
|
NS3 |
NS3 |
|
|
|
NS4 |
NS4 |
|
|
|
NS5 |
NS5 |
|
|
|
NS6 |
NS6 |
|
|
|
NS7 |
NS7 |
|
注意：NS = NADH标准，BL =空白对照，TS =测试样品
表2.每个孔的试剂组成
|
NADH Standard |
Blank Control |
Test Sample |
|
Serial Dilutions*: 50 μL |
PBS: 50 μL |
50 μL |
*注意：将连续稀释的NADH标准品（0.078μM至5μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份。 高浓度的NADH（例如，>100μM，最终浓度）将导致饱和信号并使校准曲线非线性。
4.2将50μLNAD/ NADH反应混合物（来自步骤2.2）加入NADH标准品，空白对照和测试样品（来自步骤4.1）的每个孔中，以使总NAD / NADH测定体积为100μL/孔。
4.3在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。
4.4使用吸光度读板仪在460 nm处检测吸光度的增加。
5.运行NAD / NADH比率分析（总共250个分析/试剂盒）：
5.1如表3和4中所述，将连续稀释的NADH标准品和/或含NAD / NADH的测试样品加入白色/透明96孔微孔板中。
注意：根据需要准备细胞或组织样本。 为方便起见，裂解缓冲液（组分G）可用于裂解细胞（详见附录）。
表3.白色/透明96孔微孔板中NADH标准品和测试样品的布局
|
BL |
BL |
TS |
TS |
TS (NAD) |
TS (NAD) |
|
NS1 |
NS1 |
…. |
…. |
…. |
…. |
|
NS2 |
NS2 |
|
|
|
|
|
NS3 |
NS3 |
|
|
|
|
|
NS4 |
NS4 |
|
|
|
|
|
NS5 |
NS5 |
|
|
|
|
|
NS6 |
NS6 |
|
|
|
|
|
NS7 |
NS7 |
|
|
|
注意：NS = NAD / NADH标准; BL =空白对照; TS =测试样品; TS（NAD）=用NAD提取溶液（组分D）处理10至15分钟的测试样品，然后用中和溶液（组分E）中和。
表4.每个孔的试剂组合物
|
NADH Standard |
Blank Control |
Test Sample (NAD/NADH) |
Test Sample (NAD Extract) |
|
Serial Dilutions*: 25 μL |
PBS: 25 μL |
Test Sample: 25 μL |
Test Sample: 25 μL |
|
Component F: 25 μL |
Component F: 25 μL |
Component F: 25 μL |
Component D: 25 μL |
|
Incubate at room temperature for 10 to 15 minutes |
|||
|
Component F: 25 μL |
Component F: 25 μL |
Component F: 25 μL |
Component E: 25 μL |
|
Total: 75 μL |
Total: 75 μL |
Total: 75 μL |
Total: 75 μL |
*注意：将连续稀释的NADH标准品（0.078μM至5μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份。 高浓度的NADH（例如，>100μM，最终浓度）将导致饱和信号并使校准曲线非线性。
5.2对于NAD提取（NAD量）：将25μLNAD提取溶液（组分D）加入含有NAD / NADH的测试样品的孔中。在室温下孵育10至15分钟，然后加入25μLNADH中和溶液（组分E）以中和NAD提取物，如表3和4中所述。
对于总NAD和NADH（总量）：将25μLNAD/ NADH对照溶液（组分F）加入NADH标准品和含有NAD / NADH的测试样品的孔中。在室温下孵育10至15分钟，然后如表3和4中所述添加25μL提取对照溶液（组分F）。
注意：根据需要准备细胞或组织样本。裂解缓冲液（组分G）可用于裂解细胞（详见附录）。
5.3将75μL的NADH反应混合物（来自步骤2.2）加入NADH标准品，空白对照和测试样品（NAD / NADH和NAD提取物）（来自步骤5.1）的每个孔中，使总NADH测定体积为150μL /好。
5.4在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。
5.5使用吸光度读板仪在460 nm处检测吸光度的增加。
数据分析
空白孔（仅PBS缓冲液）中的吸光度用作对照，并从具有NADH反应的那些孔的值中减去。
图1. Amplite™比色NAD / NADH比率分析试剂盒用于使用SpectraMax酶标仪（Molecular devices）测量白色/透明96孔微孔板中的总NAD / NADH量和NAD / NADH比率。
A-总NADH和NAD剂量反应：孵育1小时可检测到低至0.1μM的总NADH。
B-NAD / NADH比：在有或没有NAD提取溶液的情况下处理等量的NAD和NADH混合物15分钟，然后在室温下用提取溶液中和。 在460nm读取信号。 基于图1B中所示的吸光度计算NAD / NADH摩尔比。
附录：使用组分D（裂解缓冲液）的测试样品制剂
1.植物细胞样品：用200mg / mL的裂解缓冲液均质化，并以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测试。
2.细菌细胞样品：离心收集细菌细胞（（10,000 g，0°C，15 min）。使用约1亿至1千万细胞/ mL裂解缓冲液，将处理后的溶液在室温下保持15分钟.2500℃离心 转速5分钟，并用上清液进行试验。
3.哺乳动物细胞样品：从平板孔中取出培养基，每1-5百万个细胞使用约100μL裂解缓冲液（或在96孔细胞培养板中使用50-100μL/孔），并将处理过的溶液保持在室温下 15分钟。 直接使用细胞裂解液或以1500 rpm离心5分钟，使用上清液进行测试。
4.组织样品：称取约20mg组织，用冷PBS洗涤。 在微量离心管中用400μl裂解缓冲液均化。 以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测定。
参考文献
β-Lapachone protects against doxorubicin-induced nephrotoxicity via NAD+/AMPK/NF-kB in mice
Authors: Davoud Sanajou, Saeed Nazari Soltan Ahmad, Vahid Hosseini, Ashkan Kalantary-Charvadeh, Yasser Marandi, Leila Roshangar, Saman Bahrambeigi, Mehran Mesgari-Abbasi
Journal: Naunyn-Schmiedeberg’s archives of pharmacology (2019): 1–8
Enhanced NADH Metabolism Involves Colistin-Induced Killing of Bacillus subtilis and Paenibacillus polymyxa
Authors: Zhiliang Yu, Yuyi Zhu, Jianv Fu, Juanping Qiu, Jianhua Yin
Journal: Molecules (2019): 387
Engineering Corynebacterium crenatum for enhancing succinic acid production
Authors: Xiaoju Chen, Yaojie Zhou, Di Zhang
Journal: Journal of Food Biochemistry (2018): e12645
Influence of Boric Acid on Energy Metabolism and Stress Tolerance of Candida albicans
Authors: Martin Schmidt, Dominic Tran-Nguyen, Patrick Chizek
Journal: Journal of Trace Elements in Medicine and Biology (2018)
Loss of sirtuin 1 and mitofusin 2 contributes to enhanced ischemia/reperfusion injury in aged livers
Authors: Sung Kook Chun, Sooyeon Lee, Joseph Flores-Toro, Rebecca Y U, Ming-Jim Yang, Kristina L Go, Thomas G Biel, Catherine E Miney, Schiley Pierre Louis, Brian K Law
Journal: Aging Cell (2018): e12761
Norisoboldine, a natural AhR agonist, promotes Treg differentiation and attenuates colitis via targeting glycolysis and subsequent NAD+/SIRT1/SUV39H1/H3K9me3 signaling pathway
Authors: Qi Lv, Kai Wang, Simiao Qiao, Ling Yang, Yirong Xin, Yue Dai, Zhifeng Wei
Journal: Cell death & disease (2018): 258
Optically-controlled bacterial metabolite for cancer therapy
Authors: Di-Wei Zheng, Ying Chen, Zi-Hao Li, Lu Xu, Chu-Xin Li, Bin Li, Jin-Xuan Fan, Si-Xue Cheng, Xian-Zheng Zhang
Journal: Nature communications (2018)
Stochastic expression of lactate dehydrogenase A induces Escherichia coli persister formation
Authors: Naoki Yamamoto, Rino Isshiki, Yuto Kawai, Daiki Tanaka, Tetsushi Sekiguchi, Shinya Matsumoto, Satoshi Tsuneda
Journal: Journal of Bioscience and Bioengineering (2018)
Celastrol attenuates angiotensin II mediated human umbilical vein endothelial cells damage through activation of Nrf2/ERK1/2/Nox2 signal pathway
Authors: Miao Li, Xin Liu, Yongpeng He, Qingyin Zheng, Min Wang, Yu Wu, Yuanpeng Zhang, Chaoyun Wang
Journal: European Journal of Pharmacology (2017): 124–133
Cytosolic Redox Status of Wine Yeast (Saccharomyces Cerevisiae) under Hyperosmotic Stress during Icewine Fermentation
Authors: Fei Yang, Caitlin Heit, Debra L Inglis
Journal: Fermentation (2017): 61
相关产品
| 产品名称 | 货号 |
| Amplite NADP/NADPH比率检测试剂盒(比色法) | Cat#15274 |
| Amplite NAD/NADH比率检测试剂盒（荧光法） 红色荧光 | Cat#15263 |
| Amplite NADH检测试剂盒（荧光法） 红色荧光 | Cat#15261 |
