Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG 可精准检测目标 RNA,多重扩增检测性能优异,一次可检测多达 5 个靶标。
· 单管预混液剂型使反应体系的建立更便捷
· 4X 浓度的预混液可增加样品加入量,提高 RT-qPCR 灵敏度
· 一次可检测多达 5 个靶标,增加检测通量
· Luna 温启动反转录酶与 Taq 热启动 DNA 聚合酶联合使用,提高反应特异性及稳定性,并可室温建立体系
· 预混液中包含 UDG 和 dUTP,防止模板残留污染
· 无干扰的可见示踪染料避免加样错误
· 点击 COVID-19 research 了解 NEB 如何将多种 RT-qPCR 病毒检测方法用于新冠研究
Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG 用于探针法实时荧光定量检测靶标 RNA。首先反转录酶将 RNA 转化为 cDNA,然后 DNA 聚合酶对 cDNA 进行扩增,完成靶标的实时荧光定量 PCR(qPCR),整个过程在单管内一次性完成。基于探针法的 qPCR / RT-qPCR 原理是利用聚合酶的 5´ → 3´ 外切酶活性,将淬灭的目标特异性探针切断发出荧光,并实时监测荧光值的增加,以测量每个循环中的 DNA 扩增。在荧光信号显著超过背景荧光的位置,可以确定 Cq 值。Cq 值可用于评估两个或多个样品的靶基因相对丰度。
该预混液基于探针法化学原理,采用一步法 RT-qPCR 流程,因此可与 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒(NEB #E3006)进行对比
图 1:用于一步法 RT-qPCR 实验的新产品
Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 预混液,含 UDG 为 4X 浓度,因此在靶标 RNA 量极低的应用中(例如:病原体检测),可提高样品加入量。通过对 5 个靶标进行不同浓度的线性、灵敏度检测,显示该产品在多重检测中性能更优。该预混液将一步法 RT-qPCR 所需组分整合到单个试管中,包括:Luna 温启动反转录酶、Taq 热启动 DNA 聚合酶、dNTP 和小鼠 RNase 抑制剂。Taq 热启动 DNA聚合酶与新型温启动反转录酶联合使用,可通过基于适配体的可逆抑制来双重控制酶的活性。这种温控活化机制可避免热循环前的非特异扩增,从而让室温建立体系更安全。经改造的 Luna 温启动反转录酶具有更高的热稳定性,最佳反应温度为 55°C。此外,预混液还添加了独特矫对染料,可与多种 qPCR 仪器兼容,包括需要高 ROX 或低 ROX 参比信号的仪器。
图 2:使用 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG 对不同 RNA 病毒进行检测显示性能卓越
使用 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG 对 SARS-CoV-2(N1)和流感病毒 H1N1(HA)进行 RT-qPCR。反应体系为 20 ul,对 5-log 浓度梯度样品进行扩增性能评估,使用两台荧光定量仪器进行平行测试。(A)10–100,000 拷贝合成 SARS-CoV-2 RNA 对照 2(Twist Biosciences,SKU:102024)溶于 10 ng Jurkat 总 RNA 中(BioChain,#R1255815-50)。(B)12.4–124,000 拷贝甲型流感病毒(H1N1)RNA(ATCC®VR-95DQ™)溶于 10 ng Jurkat 总 RNA 中。结果显示两个病毒靶标扩增的灵敏度和线性度都很理想。
图 3:使用 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG 进行多重检测(5 个靶标)
使用 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG 对 5-log 浓度梯度的 Jurkat 总 RNA(100 ng-10 pg)进行多重 RT-qPCR,实验仪器为 Bio-Rad CFX96 荧光定量仪。结果显示了 5 个人源靶基因的扩增标准曲线和扩增效率。反应体系(20 μl)中引物和探针浓度均为 200 nM,反应设置为产品推荐的循环条件。在该多重反应中,5 个靶标均检测到良好的线性度、扩增效率和 R2 值。
图 4:Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG 性能优于其它品牌
图 5:RT-qPCR 避免模板残留污染的评估
为了评估不同试剂盒对去除模板残留物的能力,首先使用 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒制备含 U 的 RT-qPCR 产物。然后使用三种不同的 RT-qPCR 预混液(均包含 UDG),将~105 拷贝的含 U 产物作为模板进行 qPCR。按照各品牌的操作说明,在第二个反应开始时进行 25°C 孵育使 UDG 降解含 dU 样品,以降低其产生(假)阳性信号的能力。ΔCq 是进行残留处理及未处理的循环数的差值。ΔCq 值越大说明去除残留产物的效率越高。使用 Luna 预混液去除污染后,一个样品中含 U 产物完全消化,另一个样品 ΔCq 较大。注意:在真实污染案例中,污染的 DNA 量很难评估/预测。
该预混液包含无荧光的可见蓝色示踪染料,有助于透明管加样。该示踪染料与 qPCR 常用荧光基团的光谱没有重叠,也不会干扰实时检测。